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多目標測量：ROI manager與形態學分析

在許多生物影像中，我們需要一次測量多個物件（例如細胞、胚胎）。手動一個個圈選不僅耗時，也容易出錯。本章節將以 embryos.jpg 範例影像為例，進行標準的自動化分析流程：從影像分割、形態學處理，到使用 ROI Manager 進行批次測量。

1. 準備工作：開啟影像、校正與設定

在進行任何測量之前，首要步驟是確保影像設定正確，讓後續的數據具有科學意義。

  1. 開啟範例影像： File > Open Samples > Embryos.jpg。
  2. 設定比例尺： 為了讓測量結果具有物理意義（如 µm²），而不是像素（pixels），必須進行空間校正。請使用直線工具量測後，執行 Analyze > Set Scale... 來設定。。
  3. 設定測量項目：
    • 執行 Analyze > Set Measurements...。
    • 在對話框中，勾選感興趣的測量項目，例如：Area、Mean gray value、Perimeter、Fit Ellipse 和 Shape descriptors。
    • 點擊 OK。此設定將會應用於後續所有的測量指令。

2. 自動化分析流程

此流程適用於快速、大量地處理特徵較為一致的物件。

步驟 2.1: 影像分割

我們的目標是產生一張黑白分明的二值化遮罩 (Binary Mask)，其中白色代表胚胎，黑色代表背景。

  1. 轉換為灰階： 這是一張彩色影像，但分割通常在單一灰階通道上進行。執行 Image > Type > 8-bit。
  2. 閾值分割 (Thresholding)： 執行 Image > Adjust > Threshold... (快捷鍵 Ctrl+Shift+T)。ImageJ 會自動選擇一個閾值，觀察影像，大部分胚胎應該被標示為紅色。點擊 Apply，將影像轉換為黑白的二值化影像。

此時我們的分割結果可能不完美，這可以用形態學處理解決。

步驟 2.2: 形態學處理 (清理與分離物件)

之前課程曾經提過的部份，請觀察後實作，目標是得到一張乾淨、且每個胚胎都獨立分開的二值化遮罩。

步驟 2.3: 自動選取並傳送至 ROI manager

現在，我們使用 Analyze Particles 功能來自動偵測所有胚胎，並將它們的輪廓統一交給 ROI manager。

  1. 執行粒子分析：
    • 執行 Analyze > Analyze Particles...。
    • 在對話框中進行以下關鍵設定：
      • Size (pixel^2): 設定一個合理的範圍，例如 500-Infinity，以過濾掉分割後可能殘留的微小雜訊點。
      • Show: 選擇 Outlines。這會產生一張新的影像，顯示所有被偵測到的物體輪廓。
      • 勾選 Display results：顯示測量結果表格。
      • 勾選 Add to Manager：此選項會將每一個被偵測到的物體輪廓作為一個獨立的 ROI，自動加入到 ROI manager中。
    • 點擊 OK。

3. 手動選取流程

雖然自動化流程很強大，但有時你需要測量的目標不規則、自動分割效果不佳，或只想分析其中幾個特定物件。在這種情況下，手動選取結合ROI manager是更精確、更靈活的方法。

  1. 開啟 ROI manager： 如果尚未開啟，請執行 Analyze > Tools > ROI Manager...。
  2. 手動圈選： 在主工具列選擇一個選取工具，例如 手繪選取工具 (Freehand Selection)。
  3. 仔細地沿著第一個胚胎的邊緣畫出輪廓。
  4. 加入manager： 在 ROI manager視窗中，點擊 Add [t] 按鈕。第一個胚胎的選區 (ROI) 就被儲存起來了。
  5. 重複步驟 3 和 4，直到所有你想測量的胚胎都已圈選並加入到 ROI manager中。

4. 使用 ROI manager進行批次測量與分析

無論是透過自動還是手動流程，最終我們都得到了一個包含多個選區的 ROI manager。

步驟 4.1: 批次測量

在 ROI manager視窗中，點擊 Measure 按鈕。ImageJ 會對清單中的每一個 ROI 進行測量，並將結果逐行顯示在 "Results" 表格中。

步驟 4.2: 數據分析與匯出

  1. 計算基本統計：
    • 在 "Results" 表格的選單中，選擇 Results > Summarize。
    • 一個新的 "Summary" 視窗會彈出，自動計算出每一欄數據的平均值 (Mean)、標準差 (Standard Deviation) 等統計資訊。
  2. 繪製分佈圖：
    • 在 "Results" 表格中，點擊你想分析的欄位標題（例如 Area），使其反白。
    • 執行 Results > Distribution...，ImageJ 會產生該欄數據的直方圖，讓你直觀地看到分佈情況。
  3. 導出數據進行進階分析：
    • 在 "Results" 表格中，選擇 File > Save As...。
    • 將檔案儲存為 .csv 格式。這個檔案可以輕易地被 Excel、Google Sheets 或其他統計軟體開啟，以進行更深入的分析與圖表繪製。

步驟 4.3: ROI 管理與視覺化

ROI manager的其他功能：