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數位影像基礎知識

在開始進行影像分析之前，了解構成數位影像的基本元素至關重要。這些基礎知識將幫助你更有效地使用ImageJ等工具，並確保分析結果的準確性。

動手做：開啟範例影像

為了理解接下來的概念，讓我們先開啟一個ImageJ內建的範例影像。後續的實作部分都將基於這張影像。

1. 在ImageJ中，點擊選單列的 File > Open Samples。
2. 從下拉列表中選擇 Fluorescent Cells.tif。

你會看到一張包含多個細胞的螢光影像，我們將用它來探索基礎知識。

1. 像素 (Pixel)

像素（Pixel, Picture Element的縮寫）是數位影像的最小單位。

你可以將一張數位影像想像成一個巨大的棋盤格，每一個小方格就是一個像素。每個像素都帶有一個數值，用來表示該位置的亮度或顏色。

實作：觀察像素值 (Pixel Values)

1. 將滑鼠游標移動到剛剛開啟的 Fluorescent Cells.tif 影像上。
2. 觀察ImageJ主視窗的狀態列（Status Bar）。

你會看到類似以下的資訊： x=123, y=45, value=10,220,55

• x=123, y=45 是游標所在位置的像素座標。
• value=10,220,55 代表這個像素的顏色值，分別對應紅(R)色、綠(G)色、藍(B)色三個通道的強度。這是一張 8-bit RGB 影像，所以每個通道的數值範圍都是 0-255。

進階實作：使用 Pixel Inspection Tool

雖然狀態列提供了基本的像素資訊，但Fiji內建了一個更強大的工具 Pixel Inspection Tool，可以更詳細地顯示像素值。這個工具通常內建於Fiji中，無需額外安裝。

如何啟用:

1. 點選 toolbar的 “>>” 按鈕，選擇 Pixel Inspector。

如何使用:

1. 將滑鼠游標再次移動到 Fluorescent Cells.tif 影像上。
2. 觀察 "Pixel Inspector" 視窗。

會看到一個即時更新的表格，詳細列出： - x, y: 游標的座標。 - R, G, B: 紅、綠、藍三個通道各自的 8-bit 數值 (0-255)。 - Brightness: 綜合亮度值。 - HSB: 色相、飽和度、亮度的值。

這個工具對於需要精確讀取多個通道數值，或是在不同色彩空間下檢視像素時非常有用。

2. 影像解析度 (Image Resolution)

解析度描述了一張影像包含多少像素，通常表示為「寬度 × 高度」。

例如，一張 1024 × 768 的影像，代表它在水平方向有1024個像素，垂直方向有768個像素。

• 高解析度意味著影像包含更多像素，細節更豐富，但檔案也更大。
• 低解析度的影像像素較少，細節較模糊，檔案較小。

注意： 解析度與影像的「實際尺寸」是不同的概念。實際尺寸需要透過「比例尺校正」將像素單位轉換為物理單位（如微米 μm）。

3. 位元深度 (Bit Depth)

位元深度決定了每個像素可以記錄多少種不同的灰階或顏色層次。 它是影像動態範圍（Dynamic Range）的關鍵。

什麼是動態範圍？

動態範圍是指一張影像能夠同時記錄的最亮和最暗細節的範圍。

• 高動態範圍 (High Dynamic Range, HDR): 就像人眼一樣，能夠在同一個場景中，既看清楚陽光下的物體，也能看清陰影裡的細節。在科學影像中，這意味著能同時捕捉到微弱的螢光訊號和強烈的背景訊號，而不會讓暗部變成全黑（資訊丟失）或亮部變成全白（訊號飽和）。
• 低動態範圍 (Low Dynamic Range, LDR): 影像很難同時兼顧亮部和暗部的細節。如果為了看清暗部而增加曝光，亮部就會過曝；反之，為了保留亮部細節，暗部就會一片死黑。

位元深度越高，可記錄的灰階層次越多，動態範圍就越寬。

位元深度以「位元（bit）」為單位，n-bit的影像可以有 2ⁿ 個不同的數值。

• 8-bit (8位元):

  • 2⁸ = 256 個灰階層次（數值範圍 0 到 255）。
  • 這是最常見的影像格式（如JPEG、PNG），足以應付一般視覺需求。
  • 缺點： 對於需要精確定量分析的科學影像，256個層次可能不足以捕捉微弱訊號和強烈訊號間的細微差異。

• 16-bit (16位元):

  • 2¹⁶ = 65,536 個灰階層次（數值範圍 0 到 65535）。
  • 科學影像首選。 它提供了更寬的動態範圍，能同時記錄非常微弱和非常強烈的訊號，而不會輕易飽和（過曝）或丟失細節。
  • 適合用於螢光定量、蛋白質表達量分析等。

• 32-bit (32位元, 浮點數):

  • 可以表示小數甚至負數。
  • 通常不是由相機直接產生，而是影像計算（如影像相減、比例運算）後的結果。

位元深度	灰階層次	數值範圍	主要應用
8-bit	256	0 ~ 255	一般影像、網頁圖片、基礎展示
16-bit	65,536	0 ~ 65,535	科學定量分析、螢光顯微影像
32-bit	> 40億	浮點數	影像計算結果、進階分析

為什麼重要？ 如果用8-bit影像進行定量分析，可能會因為動態範圍不足而得到不準確的結果。例如，一個微弱的螢光訊號在8-bit影像中可能直接被記錄為0，但在16-bit影像中可能被記錄為一個可測量的數值（如500）。

4. 通道 (Channel)

通道是儲存特定類型顏色或訊號的灰階影像。

• 灰階影像 (Grayscale):

  • 只有一個通道，代表亮度（Intensity）。

• RGB彩色影像 (RGB Color):

  • 由三個通道組成：紅色（Red）、綠色（Green）和藍色（Blue）。
  • 這三個通道的灰階影像疊加混合後，就產生了我們看到的彩色影像。
  • ImageJ可以將RGB影像分離成三個獨立的8-bit灰階通道。

• 多通道影像 (Multi-channel):

  • 在螢光顯微鏡中非常常見。影像可以包含多個通道，每個通道對應一種特定的螢光染劑（如DAPI對應藍色通道，GFP對應綠色通道）。
  • 這些通道在物理上是獨立的，可以分開進行分析，也可以合併成偽彩色的合成影像（Composite Image）來觀察不同分子的共定位（Colocalization）。

實作：分離顏色通道 (Splitting Channels)

要單獨分析每個顏色，我們需要將它們分離，這個操作可以完美地展示「通道是儲存特定訊號的灰階影像」這個核心概念。

1. 確保 Fluorescent Cells.tif 影像視窗是當前選中的視窗。
2. 執行 Image > Color > Split Channels。

ImageJ會將原始的彩色影像關閉，並產生三個新的8-bit灰階影像視窗，分別名為 (red), (green) 和 (blue)。

• 觀察結果：
  • 在 (blue) 視窗中，細胞核區域最亮，代表DAPI染劑的訊號。
  • 在 (green) 視窗中，細胞質區域最亮，代表另一種螢光染劑的訊號。
  • 在 (red) 視窗中，影像整體偏暗，代表紅色通道的訊號很弱。

現在可以對每一個灰階通道進行獨立的分析，例如測量細胞核的平均亮度。

實作：合併顏色通道 (Merging Channels)

分離通道後，我們也可以將這些獨立的灰階影像重新合併成一張彩色的合成影像（Composite Image）。這在你分別對不同通道進行處理後，想觀察它們疊加效果時非常有用。

1. 確保剛剛分離出的三個灰階影像視窗 (red), (green), (blue) 都還開著。
2. 執行 Image > Color > Merge Channels...。
3. 這時會彈出一個對話框，讓你為不同的顏色通道（C1-Red, C2-Green, C3-Blue 等）指定對應的影像。
4. ImageJ 通常會很聰明地根據視窗名稱自動配對，請確認：
   • C1 (red): 對應到 (red) 影像。
   • C2 (green): 對應到 (green) 影像。
   • C3 (blue): 對應到 (blue) 影像。
   • 如果配對錯誤，可以手動從下拉選單中選擇正確的影像。
5. 勾選 Create composite 選項。這會產生一個多通道的合成影像，而不是一個簡單的RGB影像，讓你之後還能獨立控制每個通道的顯示。
6. 點擊 OK。

觀察結果：

ImageJ 會關閉原本的三個灰階視窗，並產生一個名為 Composite 的新視窗。這就是合併後的彩色影像。

• 合成影像的優點： 在這個 Composite 視窗中，數據仍然是分通道儲存的。你可以隨時執行 Image > Color > Channels Tool... 來獨立開關某個通道的顯示、調整其顏色（例如將紅色通道改成洋紅色）或調整亮度對比，而不會影響到其他通道的原始數據。這對於多通道影像的可視化與分析非常靈活。

5. 直方圖 (Histogram)

直方圖是一張圖表，顯示了影像中每個灰階值（從最暗到最亮）的像素數量分佈。

它是評估影像品質的快速工具。

• 操作： 在ImageJ中，選擇 Analyze > Histogram。

• 判讀：

  • 曝光不足 (Underexposed): 像素值集中在左側（暗部）。
  • 曝光過度 (Overexposed): 像素值集中在右側（亮部），且最右側有「截斷」現象，代表訊號飽和，細節已遺失。
  • 對比度低 (Low Contrast): 像素值集中在中間一個很窄的範圍。
  • 良好曝光 (Well-exposed): 像素值分佈在整個範圍內，沒有明顯的截斷。

實作：結合通道與直方圖分析

步驟 1: 分析原始彩色影像的直方圖

1. 開啟 File > Open Samples > Fluorescent Cells.tif。
2. 執行 Analyze > Histogram (或按快捷鍵 Ctrl+H)。
3. 在彈出的直方圖視窗中，你可以看到 Red, Green, Blue 按鈕。點擊它們，可以分別查看每個顏色通道的灰階分佈，而無需分離影像。這有助於快速判斷影像中主要的訊號來源在哪個通道，以及每個通道的曝光情況。

步驟 2: 分離通道並分析單一通道的直方圖

1. 回到 Fluorescent Cells.tif 影像視窗，執行 Image > Color > Split Channels 將其分離成三個灰階影像。
2. 現在，點選其中一個新的灰階影像視窗，例如 (blue)。
3. 再次執行 Analyze > Histogram。

這次，直方圖視窗只會顯示藍色通道的灰階分佈。這對於後續設定閾值（Thresholding）以分割細胞核等操作至關重要，因為閾值設定通常是在單一的灰階影像上進行的。

6. 選區 (Region of Interest, ROI)

選區 (ROI) 是你在影像上定義的一個特定區域，用於進行局部測量或操作。這是影像分析最基本也最重要的概念之一，它讓你能將分析範圍從整張影像聚焦到感興趣的物體上，例如單一細胞或細胞核。

實作：使用選區分析局部直方圖

我們可以結合「選區」與「直方圖」來比較影像中不同區域的特性。

1. 選取細胞核:

   • 在 Fluorescent Cells.tif 影像上，從工具列選擇橢圓選取工具 (Oval Selection Tool)。
   • 在其中一個細胞核（藍色最亮的圓點）周圍畫一個橢圓，將其框住。

2. 分析選區直方圖:

   • 在有選區的狀態下，再次執行 Analyze > Histogram (或按 Ctrl+H)。
   • 觀察： 這次的直方圖只會計算並顯示橢圓選區內的像素分佈。你會看到藍色通道 (Blue) 的數值主要分佈在較高的亮度區，而綠色 (Green) 和紅色 (Red) 通道則偏低。

3. 選取背景並比較:

   • 點擊影像中任意一個沒有細胞的黑色背景區域，剛剛的選區會消失。
   • 同樣用橢圓工具在背景區域畫一個差不多大小的選區。
   • 再次執行 Analyze > Histogram。
   • 觀察： 現在的直方圖中，所有通道的像素值都集中在左側的低亮度區。

透過這個簡單的操作，我們就能以定量的方式（直方圖）清晰地分辨出「訊號」（細胞核）與「背景」的差異。之後的所有測量與分析，幾乎都是基於對特定ROI的操作。

7. 元數據 (Metadata)

元數據是「關於數據的數據」，即儲存在影像檔案中，用來描述影像的附加資訊。

對於科學影像，元數據至關重要，它包含了實驗的關鍵參數。

• 常見元數據：
  • 影像維度： 寬度、高度、深度（Z-stack）、時間點（Time-series）、通道數。
  • 校正資訊 (Calibration Data): 像素的物理尺寸、灰階值的物理意義。
  • 顯微鏡設定： 物鏡倍率、曝光時間、雷射強度等。

為什麼重要？ 沒有元數據，你的測量結果（如細胞面積、遷移速度）就只是像素單位，失去了物理意義。ImageJ的Bio-Formats外掛在讀取專有顯微鏡格式時，能最大程度地保留這些元數據。

8. 影像校正：賦予像素物理意義 (Image Calibration)

原始的數位影像只包含像素座標和像素值，這些數據本身沒有物理意義。為了進行科學的定量分析，我們必須進行校正（Calibration），將這些抽象的數字與真實世界的物理單位聯繫起來。校正主要分為兩種類型：空間校正和強度校正。

8.1 空間校正 (Spatial Calibration)

空間校正的目的是將像素單位（pixel）轉換為有意義的物理長度單位（如微米 µm, 毫米 mm）。

• 為什麼重要？ 如果沒有空間校正，你測量的面積、長度、周長等所有形狀特徵的單位都只是「像素」。校正後，你才能得到例如「細胞核面積為 50.2 µm²」這樣具有科學意義的結果。
• 如何進行？ 通常是透過 Analyze > Set Scale... 功能，告訴 ImageJ 影像中特定像素長度對應的真實距離。

實作：查看已進行空間校正的影像

讓我們開啟一個已經包含空間校正資訊的範例影像。

1. 開啟 File > Open Samples > Confocal Series (2.2MB)。
2. 執行 Image > Show Info... (或按快捷鍵 Ctrl+I)。

你會看到類似以下的元數據：

Title: confocal-series.tif
Width:  24.0800 µm (400)
Height:  24.0800 µm (400)
Voxel size: 0.0602x0.0602x0.1250 µm^3
Unit:  micron
...

觀察與比較：

• 你會發現有明確的物理單位資訊，如 Pixel width: 0.0602 microns 和 Unit: micron。
• 這表示，如果你現在使用直線工具在這張影像上測量長度，得到的單位將是「microns」，而不是「pixels」。