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影像強度校正 (Intensity Calibration)

教學影片

1. 什麼是強度校正？

強度校正（Intensity Calibration）是將影像中無單位的像素灰階值（例如 8-bit 的 0-255）轉換為具有實際物理意義單位的過程。這個功能對於科學定量分析至關重要，它能讓您的測量結果從「相對亮度」變成「絕對物理量」。

校正的方法是透過一組「已知標準品」建立一個轉換模型（校正曲線），然後將這個模型應用於整張影像。

2. 為什麼需要進行強度校正？——非線性的世界

一個常見的誤解是，影像的灰階值與我們想測量的物理量（如濃度、放射性）之間是簡單的線性關係。然而，在絕大多數情況下，這種關係是非線性的。

為什麼關係通常是非線性的？

• 成像設備的非線性響應： 相機、掃描儀或感測器本身對光線強度的反應通常不是完美的線性。在低光或高光區域，訊號可能會被壓縮或飽和。一張「亮兩倍」的影像，其灰階值不一定剛好是原來的兩倍。
• 物理過程本身的非線性： 許多科學實驗的底層物理或化學過程就是非線性的。
• 影像後處理的影響： 成像軟體或硬體內建的預處理（如對比度拉伸、Gamma校正）會改變像素值與原始訊號的對應關係。
• 儲存格式的限制： 大部分影像是 8-bit 格式，只能記錄 256 個灰階層次。真實世界中微小的物理量變化可能因為數位化而被歸入同一個灰階值，導致精度損失。

因此，校正是必要的，因為它能將失真的像素值對應回一個具有真實物理意義的數值，使數據變得可靠、可比較。

3. 常見應用場景

• 放射性測量 (Radioactive Isotope Imaging):

  • 應用： 核醫學、放射生物學。
  • 說明： 使用不同濃度的放射性標準樣本建立校正曲線，將灰階值對應為放射活性（如 Bq/mL），從而定量分析樣品中的放射性分布。

• 光密度計校正 (Optical Density Calibration):

  • 應用： 膠片掃描、X光片數位化。
  • 說明： 使用已知光密度（Optical Density, OD）值的標準灰階板，將影像的像素灰階值轉換為實際的OD值。

• 凝膠電泳定量 (Gel Electrophoresis Quantification):

  • 應用： 分子生物學（如 Western blot、DNA 凝膠）。
  • 說明： 透過一組已知濃度的標準條帶建立校正曲線，從而估算未知樣本條帶的濃度。

• 螢光/吸光度影像分析 (Fluorescence/Absorbance Imaging):

  • 應用： 顯微影像、ELISA 微量盤讀取。
  • 說明： 利用已知濃度的螢光探針或染劑建立標準曲線，讓灰階值轉換為濃度單位（如 μM、ng/mL）。

• 材料科學 (Materials Imaging):

  • 應用： 掃描電子顯微鏡（SEM）、X-ray CT。
  • 說明： 將灰階值轉換為物理量（如厚度、密度），幫助進行材料結構的定量分析。

4. 如何在 ImageJ 中進行校正

ImageJ 的 Analyze > Calibrate... 功能可以幫助我們完成這個過程。

以下的課程將使用中央氣象署的雨量日累積圖來進行教學。請進入中央氣象署網站下載雨量日累積圖，請下載灰階版本。

或使用此範例雨量圖

1. 下載後請用imagej開啟，先打開Image > Show Info，因為是尚未做強度校正的影像，所以會有一段Uncalibrated的文字。我們在校正後會再來看這段文字的變化。
2. 雖然這張圖是灰階影像，但目前其實還是RGB，所以要先轉換成真的灰階，執行 Image › Type › 8-bit。
3. 使用方框選取工具，針對右邊的灰階與雨量關係的bar進行測量，每框好一個位置，就執行 Analyze > Measure (或按 Ctrl+M) 記錄下每個標準品區域的平均灰階值（Mean Gray Value），這會在result表格中紀錄該區域的平均強度。
4. 由上而下測量每一個格子的強度之後，執行 Analyze > Calibrate...。
   • 左側的欄位會自動導入result的灰階值。
   • 在右側的欄位中，手動輸入每個灰階值對應的真實物理量。
   • 從 Function 下拉選單中，選擇一個最適合您數據的擬合曲線。ImageJ 提供了多種選項，包括線性、多項式以及適用於飽和曲線的 Rodbard 函式。
   • 在 Unit 欄位中，輸入物理量的單位（如 OD, μg/mL, Bq），這裡我們輸入mm。
   • 點擊 OK。ImageJ 會根據您建立的校正曲線，將整張影像的灰階值轉換為已校正的數值。
5. 強度校正之後，當你將滑鼠移動到影像上，狀態列顯示的 value 將不再只有 0-255 的灰階值，而是帶有物理單位的校正後數值。之後的所有測量也將使用這個新單位。
6. 請再打開Image > Show Info，觀察原本的ˊUncalibrated變為什麼？
7. 在地圖上用直線工具劃線，再使用Analyze > Plot Profile ，你可以看到不同像素代表的雨量差異。
8. (選擇)如果你還進行了空間校正，也可以把像素變成實際的單位，例如公尺或經緯度。再搭配Image › Adjust › Coordinates...就能夠調整座標的起點和終點。
9. 我們可利用Analyze › Tools › Calibration Bar... 將強度校正的Calibration Bar加入圖中，你可以勾選overlay，這樣就可以選擇性的顯示或隱藏。 overlay的顯示或隱藏，可以用Image › Overlay來控制。

關於 Rodbard 曲線

Rodbard 是一種常用於生物測定分析的四參數邏輯擬合函式，其公式為： y = d + (a - d) / (1 + (x / c)^b) 它非常適合描述具有「S」形或飽和特性的數據，例如螢光強度與蛋白質濃度的關係，能夠準確地反映「初期變化快、後期趨緩」的典型科學現象。

案例說明

Cold atmospheric plasma-induced acidification of tissue surface: visualization and quantification using agarose gel models，此研究用螢光標記pH建立標準品，然後用 Rodbard曲線校正，後續分析就用灰階值推論pH變化程度。