TrackMate plugin 應用指南

TrackMate 影像追蹤教學

TrackMate 是 Fiji 影像處理軟體中一個強大且模組化的外掛程式，專門用於自動化追蹤影像中的粒子或物體，並支援手動校正和半自動追蹤。它將追蹤過程分為幾個主要步驟：

偵測 (Detection)
過濾 (Filtering)
追蹤 (Tracking)
分析/顯示 (Analysis/Display)

簡介

本教學將使用一個 C.elegans 胚胎影像會使用 Mask 偵測器進行追蹤。這個影片是從一個更長的影片中擷取的最大強度投影 (MIP)，並已針對本教學目的進行簡化。

本教學文章的資料來源：TrackMate version 7 novelties.pdf
影像來源

1. 環境設定與啟動 TrackMate

在 Fiji 中開啟影像 CelegansEarly_MIP.tif。
此影像有兩個通道：
第一個通道：包含原始影像資料，顯示經過 eGFP-H2B 染色並在雷射掃描共焦顯微鏡下成像的 C.elegans 胚胎螢光。可以看到細胞核的移動和分裂，以及兩個較小的極體。
第二個通道：包含透過以下步驟處理後的訊號分割結果：
1. 中值濾波 (Median filter)
2. 高斯濾波 (Gaussian filter)
3. 簡單的閾值處理 (Plain thresholding)
啟動 TrackMate
在 Fiji 的主選單中，選擇 Plugins (外掛) > Tracking (追蹤) > TrackMate。
TrackMate 的使用者介面 (GUI) 會以單一視窗的形式出現。

2. 初始面板：檢查影像校準與維度

TrackMate 啟動後，會首先顯示一個初始面板，讓你檢查影像的空間和時間校準資訊。
空間與時間校準：確認影像的像素大小（例如微米 µm）和幀間時間（例如分鐘 min）是否正確。
如果校準不正確，建議在 TrackMate 之外，透過 Image (影像) > Properties (屬性) (快捷鍵 Shift + P) 在 Fiji 中修改影像的元資料，然後回到 TrackMate 面板點擊 Refresh source (重新整理來源) 按鈕來更新資訊。
影像維度：確認影像維度是否正確（例如 2D 序列影像或 3D Z-stack）。
定義處理區域：你可以選擇影像中的一個 ROI (Region of Interest) 來定義 TrackMate 進行偵測的子區域。這有助於加速參數測試，特別是在處理大型影像時。
確認資訊無誤後，點擊 Next (下一步)。

3. 選擇偵測演算法 (Detector)

TrackMate 提供多種偵測演算法來識別影像中的物體。偵測器負責找出影像中的「點」(Spots) 或輪廓，並為其提供基本的數值特徵，例如座標、半徑和品質。

內建核心偵測器

Mask detector (遮罩偵測器)：從二值化遮罩影像中建立物體。物體由像素值大於 0 的連通區域組成。通常會將遮罩作為原始影像的一個額外通道。
Thresholding detector (閾值偵測器)：從灰度影像中，根據指定閾值來分割物體。
Label-Image detector (標籤影像偵測器)：從標籤影像中建立物體。標籤影像中每個物體由不同的整數值表示，這有助於分離接觸的物體。

整合的外部演算法偵測器 (TrackMate v7 及更高版本)

TrackMate v7 重新設計了內部模型，可以支援物體形狀的偵測和分析。它整合了 Fiji 中一些先進的機器學習和深度學習分割演算法：

TrackMate-Ilastik
TrackMate-MorphoLibJ：依賴 MorphoLibJ 庫中的形態分割外掛程式
TrackMate-StarDist：利用 StarDist 深度學習模型進行細胞核等物體分割
TrackMate-Weka：依賴 Trainable Weka Segmentation 外掛程式來分割物體

教學範例：我們選擇 Mask Detector (遮罩偵測器)，這在 C. elegans 的教程中被用來處理預先生成好的遮罩影像。
從下拉選單中選擇 Mask Detector，點擊 Next (下一步)。

4. 偵測器配置面板

每個偵測器都有自己的配置面板，用於調整參數。

Mask Detector 的配置

Mask Channel (遮罩通道)：指定遮罩影像所在的通道。例如，如果你的原始影像有兩個通道，第二個通道是遮罩，則選擇 Channel 2。
Simplify contours (簡化輪廓)：
- 這是一個重要的設定，建議勾選。
- 當偵測器返回物體輪廓時，這個選項會產生一個更平滑、包含更少線段的簡化形狀。
- 優點：生成更小的 TrackMate 文件，更重要的是，可以產生更準確的形態特徵，因為像素級的輪廓會高估周長，進而影響相關的形態特徵。
- 建議在物體足夠大（通常大於 10 個像素）時使用此選項，否則簡化可能導致輪廓不準確。
預覽偵測結果：點擊 Preview (預覽) 按鈕，你可以在影像上看到偵測到的物體輪廓。這有助於在正式處理所有幀之前，快速檢查參數是否合適。
確認參數後，點擊 Next (下一步)。TrackMate 將開始偵測影像中所有時間點的物體。

5. 偵測處理與初始點過濾(Initial thresholding)

偵測過程：TrackMate 會顯示一個日誌面板和進度條。它利用多核心處理器同時處理多個時間幀，以加速偵測。
初始點過濾 (Initial Spot Filtering)：
- 偵測完成後，會進入「初始點過濾」步驟。
- 此步驟的目的是在計算所有點的詳細特徵之前，根據「品質 (Quality)」值篩選掉大量不相關的點，以節省記憶體和計算時間。
- 偵測器會為每個點分配一個「品質」值，反映偵測結果的可靠性。你可以根據品質的直方圖手動設定一個閾值。低於此閾值的點將被完全丟棄，不會用於後續處理或儲存。這個步驟是不可逆的。
- 對於大多數簡單的案例，你可以將閾值條保持在接近 0 的位置，然後點擊 Next (下一步)。

教學範例：此影片中總共找到了 78 個斑點 (spots)。

6. 選擇顯示方式

此面板讓你選擇追蹤結果的顯示方式：

HyperStack Displayer (超堆棧顯示器)：將追蹤結果非破壞性地疊加在 Fiji 的影像堆棧視窗上。建議選擇此模式，因為它更輕量、更簡單，並且允許直接在影像上進行手動編輯。
3D Viewer (3D 檢視器)：在一個新的 3D 視窗中顯示物體為 3D 球體，軌跡為 3D 線條。

選擇 HyperStack Displayer，然後點擊 Next (下一步)。TrackMate 會計算所有點的特徵，並準備顯示。

7. 點過濾 (set filter on spot)

這個面板允許你根據偵測到的點的數值特徵（例如大小、形狀、位置或訊號強度）來進一步篩選點。

添加過濾器：點擊綠色 + 按鈕來添加一個新的過濾器。
選擇特徵：從下拉選單中選擇你想要過濾的特徵，例如 Area (面積)、Mean intensity (平均強度) 或 Circularity (圓度)。
- 範例：如果你的影像中有許多小雜訊點，你可以添加一個 Area (面積) 過濾器，並設定為 Above (大於) 一個特定值，以移除過小的物體。
調整閾值：你可以直接在直方圖中拖曳閾值條，或者在文字欄位中輸入精確值。影像中的顯示會即時更新。
你可以堆疊多個過濾器，TrackMate 會保留滿足所有條件的點（邏輯 AND）。
調整好過濾器後，點擊 Next (下一步)。

8. 選擇追蹤演算法 (select a tracker)

此面板讓你選擇粒子連結演算法，即「追蹤器」(Tracker)。追蹤器會將偵測到的點連結起來，形成完整的軌跡 (Tracks)。

LAP 追蹤器 (Linear Assignment Problem, LAP)：TrackMate 主要基於 Jaqaman 等人開發的線性分配問題 (LAP) 框架。
- Simple LAP tracker (簡單 LAP 追蹤器)：僅允許處理間隙閉合 (gap-closing) 事件，不處理分裂或合併事件。連結成本僅基於點之間的距離。
- LAP tracker (LAP 追蹤器)：允許偵測所有類型的事件，包括間隙閉合、分裂 (splitting)（例如細胞分裂）和合併 (merging) 事件。可根據物體特徵值差異來調整連結成本。適用於布朗運動的粒子，在粒子密度不高時也適用於非布朗運動。
Linear motion LAP tracker (線性運動 LAP 追蹤器)：適用於以大致恆定速度移動的粒子。它使用卡爾曼濾波器來預測粒子位置，並能處理短期遮蔽事件。
Nearest neighbor search tracker (最近鄰居搜索追蹤器)：最簡單的追蹤器，將一幀中的每個物體連結到下一幀中最近的物體，通常性能最差，主要用於示範。

教學範例：我們選擇 LAP tracker (LAP 追蹤器)，因為它能夠處理分裂事件 (split events) 的偵測。
從下拉選單中選擇 LAP tracker，點擊 Next (下一步)。但由於活動的極體，可能會出現錯誤的分裂，其被錯誤地連接到頂部細胞的影片。可以手動糾正，或根據面積篩選極體。

9. 追蹤器配置面板

LAP 追蹤器有幾個重要參數需要配置：

Frame to Frame linking (幀到幀連結)
- Max distance (最大距離)：設定在兩幀之間連結兩個物體的最大允許距離。如果兩個點之間的距離超過此值，它們將不會被考慮連結。
Allow gap closing (允許間隙閉合)
- 勾選此選項，允許軌跡在物體短暫消失後重新連結。
- Max distance (最大距離)：間隙閉合的最大距離。
- Max frame gap (最大幀間隙)：物體消失的最大幀數，超過此幀數將不會被連結。
Allow track segment splitting (允許軌跡段分裂)
- 勾選此選項以偵測分裂事件，例如細胞分裂。
- Max distance (最大距離)：分裂事件的最大距離。
Allow track segment merging (允許軌跡段合併)
- 勾選此選項以偵測合併事件。
- Max distance (最大距離)：合併事件的最大距離。
Feature penalties (特徵懲罰)：可以根據物體的特徵值差異來調整連結成本，例如懲罰平均強度差異大的連結。對於本示範，你可以暫時不添加。

設定好參數後，點擊 Next (下一步)，追蹤計算將開始。

教學範例：我們選擇 LAP tracker (LAP 追蹤器)，因為它能夠處理分裂事件 (split events) 的偵測。
從下拉選單中選擇 LAP tracker，點擊 Next (下一步)。但由於活動的極體，可能會出現錯誤的分裂，其被錯誤地連接到頂部細胞的影片。可以手動糾正，或根據面積篩選極體。

10. 軌跡過濾 (set filter on tracks)

追蹤完成後，你會進入「軌跡過濾」面板，可以根據軌跡的屬性（例如長度、速度或位置）移除不相關的軌跡。

你可以添加過濾器，例如 Track duration (軌跡持續時間)，設定一個閾值來移除過短的軌跡（例如，移除那些進出視野的細胞）。
可以使用多個過濾器進行過濾。
調整好過濾器後，點擊 Next (下一步)。

11. 顯示選項 (Display Options)

此面板讓你自訂點和軌跡的顯示方式。

Display spots (顯示點) 和 as ROIs (作為 ROI)：勾選這些選項以顯示偵測到的物體及其輪廓。
Color spots by (點的顏色依據)：你可以根據點的任何數值特徵，例如 Mean intensity (平均強度) 或 Area (面積) 來設定其顏色，以便視覺化不同特徵值的點。
Display tracks (顯示軌跡)：勾選此選項以顯示軌跡。
Show tracks (軌跡顯示模式)：你可以選擇軌跡的顯示模式，例如 Show tracks forward in time (向前顯示軌跡)，這會顯示物體未來的移動軌跡。
Color tracks by (軌跡的顏色依據)：你可以根據軌跡的任何數值特徵，例如 Total distance travelled (總移動距離) 或 Track mean speed (軌跡平均速度) 來設定其顏色。
點擊 Edit settings (編輯設定) 可以進一步調整顯示選項，例如繪製填滿的點 (draw spots filled) 或線條粗細 (line thickness)。

12. 匯出結果 (Export Results)

在「顯示選項」面板的底部，你通常會找到匯出結果的按鈕。

匯出 CSV 文件：點擊 Tracks (軌跡) 按鈕，你可以選擇匯出 Spots (點)、Edges (連結) 和 Tracks (軌跡) 的數值特徵資料為 .csv 文件。這些文件可以用於其他軟體（如 MATLAB）進行進一步分析。

13. 繪製特徵圖 (Plot Features)

此面板允許你將點、連結或軌跡的任何數值特徵繪製成圖表。

選擇 X 軸和 Y 軸特徵：例如，你可以將 T (時間) 作為 X 軸，Area (面積) 或 Circularity (圓度) 作為 Y 軸，以觀察細胞大小或形狀隨時間的變化。
你可以同時繪製多個 Y 軸特徵。
點擊 Plot features (繪製特徵) 按鈕生成圖表。右鍵點擊圖表可以匯出為 PDF、PNG、SVG 影像或 CSV 數據。

14. 執行動作 (Actions)

這是 TrackMate 工作流程的最後一個面板，你可以在此執行各種最終操作。

Capture overlay (捕捉疊加影像)：從下拉選單中選擇此動作，可以將追蹤結果疊加到原始影像上，並匯出為視訊或靜態影像。
- 選擇此動作後，點擊 Execute (執行)，彈出視窗中你可以定義要保存的時間間隔。TrackMate 將生成一個帶有追蹤疊加的視訊。
- 記得將生成的影像/視訊保存到你的電腦上 (File (檔案) > Save as...)。

15. 手動編輯 (Manual Editing)（簡要說明）

即使自動追蹤的結果很好，在複雜情況下仍可能需要手動校正。

TrackMate 允許你手動建立、編輯、移動或刪除點和連結，以及調整點的半徑。
在 HyperStack Displayer 中編輯點：
- A 鍵：在滑鼠位置新增一個點。
- D 鍵：刪除滑鼠下的點。
- Space (按住) + 滑鼠移動：移動滑鼠下的點。
- Q / E 鍵：減小 / 增大點的半徑。
在 HyperStack Displayer 中建立/刪除連結：
- 選擇兩個點 (Shift + Click)，然後按下 L 鍵可以建立或刪除它們之間的連結。
TrackScheme 工具：TrackScheme 是一個專門用於軌跡可視化和編輯的工具，它以分層圖的形式顯示軌跡，特別適合編輯細胞譜系。你可以從「顯示選項」面板啟動它。

繪製細胞核形狀隨時間的變化

有了細胞形狀及其譜系後，可以追蹤細胞分裂時形狀如何變化。例如，可以繪製底部細胞的細胞核大小和圓度隨時間的變化。

透過點擊其中一個斑點來選擇底部細胞。
然後移至 TrackMate 精靈的 Plot feature (繪製特徵) 面板。確保您位於 Spots (斑點) 標籤頁。
在此面板中，在 Feature for Y axis (Y 軸特徵) 的第一個列表中選擇 Area (面積)。
點擊綠色的 + 按鈕以添加第二個特徵列表，然後選擇 Circularity (圓度) 特徵。
您希望僅繪製所選斑點的軌跡 (track) 的這些特徵值。為此，請選擇底部的 Tracks of selection (所選軌跡) 單選按鈕。當然，感興趣軌跡中的至少一個斑點必須被選中。
點擊 Plot features (繪製特徵) 按鈕。會出現兩個圖表。
頂部圖表顯示面積隨時間的變化。可以看到它穩定增加直到細胞在 t=15 分鐘時分裂。面積急劇下降，並且圖表中現在繪製了兩個細胞。它們的面積恢復增加，且速率幾乎相同。
圓度繪製在第二個圖表中。它幾乎一直保持很高（接近 1），因為細胞核的形狀大致為球形。當細胞分裂時，細胞核呈現拉長的形狀，導致圓度較低。
如果您右鍵點擊任何一個圖表，會彈出一個選單，可以將圖表匯出為 PDF、PNG 或 SVG 影像，或將其資料顯示在可保存為 CSV 檔案的表格中。

編輯遮罩 (Mask)

如果對頂部細胞重複上述步驟，則會得到以下圖表。
請注意，在 t=16 分鐘時，其中一個子細胞核的圓度急劇下降。透過檢查影像，可以看到這是由於該斑點的物件輪廓不正確造成的。活動的極體離細胞核太近，遮罩將它們合併在一起。因此，得到一個人為拉長的物件，導致圓度較低。
目前，沒有辦法編輯斑點輪廓。這裡建議一個技巧，直接使用 Fiji 工具編輯二值遮罩 (binary mask) 來切割物件。

步驟

返回 TrackMate 精靈的第一個面板，並在影像顯示中，選擇第 9 個時間點，並啟用第二個通道。
放大具有缺陷遮罩的細胞核。
將在遮罩中進行切割，以將細胞核與極體分開。可以使用影像 ROI 來完成此操作。在 ImageJ 工具欄中，選擇線 ROI 工具。雙擊顏色選擇工具並選擇黑色作為前景顏色。現在繪製一條介於細胞核和極體之間的線。
按下 D 鍵繪製。由於選擇了黑色，沿著線 ROI 的像素將被替換為 0 值，將遮罩切割成兩個組件。
現在可以像以前一樣進行追蹤。極體和細胞核將被分割為兩個斑點。

目前，這是 TrackMate 中編輯斑點輪廓的唯一方法。這表示在運行 TrackMate 之前獲得良好的分割結果非常重要。

https://zenodo.org/records/5243127

TrackMate 教學：癌細胞遷移追蹤本教學將引導您完成在 TrackMate 中追蹤癌細胞的步驟，使用 Mask 偵測器來識別細胞，並設定追蹤和顯示選項。 1. 準備資料集 • 請從 Zenodo 下載本教學所需的資料集。 2. 啟動 TrackMate • 開啟 Fiji。 • 開啟您的影像檔案。 • 啟動 TrackMate：前往 Plugins > Tracking > TrackMate。 • TrackMate 啟動面板將會顯示影像的尺寸資訊。點擊 Next。 3. 選擇偵測器 • 在「Select a detector」面板中，從下拉式選單中選擇 Mask detector。 • 點擊 Next。 4. 設定 Mask 偵測器 • 將會開啟 Mask 偵測器的設定面板。 • 您可以選擇 Simplify the contours (簡化輪廓) 來平滑分割物體的邊緣。 • 點擊 Preview (預覽) 按鈕，可以預覽分割結果，左側也會顯示偵測到的物體數量。 • 完成設定後，點擊 Next。此時物體將開始被偵測。 5. 過濾斑點 (Spots) • 當進度條完成後，點擊 Next。 • 「Filter detected spots by quality」面板將會開啟。對於本範例影像，此部分可以忽略。點擊 Next。 • 「Filter spots by properties」面板將會開啟（依據大小、形狀、位置或訊號強度過濾）。對於本範例影像，無需過濾任何斑點。點擊 Next。 6. 設定追蹤器 • 追蹤面板開啟。從下拉式選單中選擇 LAP tracker。 • 點擊 Next。 7. LAP 追蹤器設定 • LAP 追蹤器的設定面板將會開啟。 ◦ Frame to Frame linking (幀間連結)：設定兩個物體之間連結的最大距離，對於本範例影像，使用 20 微米 (microns)。 ◦ Allow gap closing (允許間隙閉合)：勾選此方框。設定 Max distance (最大距離) 為 20 微米，Max frame gap (最大幀間隙) 為 5。 ◦ Allow track segment splitting (允許軌跡片段分裂)：勾選此方框（例如，因細胞分裂引起）。設定 Max distance (最大距離) 為 20 微米。 ◦ Track segment merging (軌跡片段合併)：此方框應保持未勾選，因為在此範例中不預期細胞核會合併。 • 點擊 Next。 8. 過濾軌跡 (Tracks) • 「Track filter」面板開啟。您可以在此面板中根據軌跡的屬性（例如長度、速度或位置）移除軌跡。對於本範例影像，無需過濾任何軌跡。 • 點擊 Next。 9. 顯示選項 • 顯示選項視窗將開啟，您可以在此編輯軌跡或物體的顏色。 ◦ 首先，請確保「Display spots (顯示斑點)」和「as ROIs (作為 ROI)」方框都已被勾選。這將使偵測到的斑點顯示為影像上的感興趣區域，使其可識別並可互動，進而能夠被點選 [對話歷史]。 ◦ 在「Color spots by (斑點顏色依據)」下拉式選單中，選擇 Track mean speed (軌跡平均速度)，然後點擊 auto。 ◦ 要填充物體顏色，點擊 Edit settings (編輯設定)。這將開啟一個新的顯示設定面板。勾選 draw spots filled (繪製填充斑點) 方框。 ◦ 從同一面板中，將 line thickness (線條粗細) 設定為 2。 ◦ 關閉顯示設定視窗。 ◦ 確保「Display tracks (顯示軌跡)」方框已被勾選。 ◦ 從下拉式選單中選擇 Show tracks forward in time (顯示向前時間軌跡)，這將顯示物體運動的未來軌跡。 ◦ 從「Color tracks by (軌跡顏色依據)」下拉式選單中選擇 Total distance travelled (總移動距離)，然後點擊 auto。 10. 匯出結果 • 在此面板中，您還可以將結果匯出為 .csv 檔案。點擊面板底部的 Tracks (軌跡) 按鈕。 • 一個包含大量資料的視窗將會開啟。確保您匯出 Spots (斑點資訊) 和 Tracks (軌跡資訊) 檔案。 • 關閉結果視窗，然後點擊 Next。 11. 繪製特徵 (Plot Features) • 將會看到一個「Plot features」面板。點擊 Next。 12. 擷取疊圖 (Capture Overlay) • 在下一個面板中，您可以執行多種操作。對於此練習，我們將匯出實驗的追蹤影像。 • 從下拉式選單中選擇 Capture overlay (擷取疊圖)。 • 點擊 Execute 後，將會開啟一個彈出視窗。 • 在此視窗中，您可以定義要儲存的時間間隔，然後點擊 OK。 • TrackMate 將生成一個您實驗的影片。請記得從 File > Save as... (檔案 > 另存為...) 儲存影像。處理觸碰的細胞 (Mask 編輯) • 您可能會在生成的影片中看到一些觸碰的細胞被錯誤地識別為一個物體。這是 Mask 影像的問題。 • 修復方法：您可以直接編輯二進位 Mask，方法類似於 C.elegans 早期發育教學中所示的步驟。 ◦ 返回到 TrackMate 精靈的第一個面板。 ◦ 在影像顯示區，選擇有問題的時間點（例如，在 C.elegans 教學中是第 9 幀），並將第二個通道設定為活躍狀態。 ◦ 放大有缺陷 Mask 的細胞核。 ◦ 在 ImageJ 工具欄中，選擇線 ROI 工具。 ◦ 雙擊顏色選擇工具，並選擇黑色作為前景色。 ◦ 在細胞核和極體之間繪製一條線。 ◦ 按下 D 鍵進行繪製。由於您選擇了黑色，沿著線 ROI 的像素將被替換為 0，從而將 Mask 分割成兩個部分。 ◦ 現在您可以像之前一樣繼續追蹤。這樣，極體和細胞核將被分割為兩個獨立的斑點。 • 請注意：目前這是 TrackMate 中編輯斑點輪廓的唯一方法。這意味著在運行 TrackMate 之前獲得良好的分割結果非常重要。 • 另一種解決方案：您可以返回到原始影像，並使用 StarDist 偵測器來解決這個問題。

回到首頁