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影像分割

簡介

影像分割（Image Segmentation）是將數位影像分割成多個區域或物件的過程。這在生物醫學影像分析中尤為重要，用於識別和定量分析細胞、組織、器官或其他感興趣的結構。本章節將介紹主要的影像分割技術，並特別說明如何在ImageJ軟體中實作這些方法。

基本概念與方法類型

影像分割原理

影像分割旨在將影像中的像素根據某種準則（如灰度值、顏色、紋理、空間位置等）進行分組，形成具有相似特徵的區域。主要目標通常是將前景物件與背景分離。

分割方法分類

影像分割方法大致可分為以下類型：

1. 手動分割 (Manual Segmentation)

   • 人工描繪感興趣區域（ROI）。
   • 適用場景：複雜、不規則或稀有結構；需要極高精確度的特殊案例。
   • 優點：準確度高，適用於任何影像。
   • 缺點：耗時、主觀性強、不適合大量影像處理。
   • 應用：特殊病理切片分析、複雜組織結構辨識。

2. 半自動分割 (Semi-automatic Segmentation)

   • 提供少量互動（如指定種子點、初始輪廓），程式自動完成大部分分割過程。
   • 優點：結合了人工的指導和程式的效率。
   • 缺點：仍需要一定程度的人工介入。
   • 應用：血管網路追蹤、神經纖維分析、互動式區域生長。

3. 自動分割 (Automatic Segmentation)

   • 程式根據預設算法或學習的模型完全自動進行分割。
   • 優點：效率高，適合批量處理，客觀性強。
   • 缺點：算法選擇和參數設定對結果影響大；可能無法處理所有複雜情況。
   • 主要自動方法包含：
     • 傳統方法：基於閾值、邊緣、區域等特徵。
     • 機器學習與深度學習方法：從標記數據中學習分割規則。

傳統影像分割方法

閾值分割 (Thresholding)

閾值分割是最基本且廣泛使用的自動分割方法。它根據像素的灰度值將影像分成前景和背景兩部分（二值化影像）。

• 原理： 選擇一個或多個灰度值作為閾值，將影像中的像素分為兩類：灰度值高於閾值的歸為一類（通常是前景），低於閾值的歸為另一類（通常是背景）。

• 類型：

  • 全局閾值 (Global Threshold)： 使用單一閾值應用於整張影像。適用於照明均勻且前景背景對比明顯的影像。
  • 局部閾值 / 自適應閾值 (Local / Adaptive Threshold)： 對影像不同區域使用不同的閾值。適用於照明不均勻或背景複雜的影像。

• ImageJ中的閾值分割

  • 手動閾值： 使用 Image > Adjust > Threshold... 功能。
    • 會彈出一個視窗，顯示影像的灰度直方圖和當前選擇的閾值範圍。
    • 使用者可以手動拖動滑桿或輸入數值來設定閾值範圍。
    • 影像上會實時顯示被選中的區域（通常為紅色）。
    • 選擇「Apply」後，影像會被二值化（通常前景為白色，背景為黑色）。

  • 自動閾值： 在 Image > Adjust > Threshold... 視窗中，ImageJ提供了多種內建的自動閾值算法。點擊「Auto」按鈕可以自動選擇閾值。常見的自動算法包括：

    • Otsu (最大類間變異法)
    • Triangle (基於直方圖形狀)
    • IsoData (迭代法)
    • Minimum (尋找直方圖谷值)
    • MaxEntropy
    • Li
    • Mean

  • 多重閾值： ImageJ的 Image > Adjust > Threshold... 預設是單一閾值。但可以通過腳本或一些插件實現多重閾值分割，將影像分割成多個灰度層次。

  • 自適應閾值： Image > Adjust > Auto Threshold 插件（通常需要從Plugins > Install Plugin...安裝）或一些特定的插件提供了自適應閾值選項，如根據局部區域的平均值或中位數計算閾值。

邊緣基礎分割 (Edge-Based Segmentation)

這類方法通過尋找影像中像素灰度值變化劇烈的地方來識別邊界，然後將邊界連接起來形成區域輪廓。

• 原理： 利用微分算子（如梯度）來檢測影像的邊緣。
• ImageJ中的邊緣檢測：
  • 梯度： ImageJ提供了多種濾波器來檢測邊緣。
    • Process > Find Edges 實現的是基於Sobel算子的邊緣檢測。
    • 其他算子如 Prewitt, Roberts 也可通過自定義濾波器或插件實現。
  • 拉普拉斯： 拉普拉斯算子檢測的是灰度變化的二階導數。
    • Process > Filters > Laplacian 可以應用拉普拉斯濾波器，常用於邊緣增強。
    • LoG (Laplacian of Gaussian) 是一種結合高斯平滑的邊緣檢測方法，用於減少雜訊對邊緣檢測的影響，可通過插件實現。
• 邊緣追蹤與連接： 檢測到的邊緣可能不連續，需要後續的邊緣追蹤和連接步驟來形成完整的邊界，這通常涉及更複雜的算法或手動編輯。

區域基礎分割 (Region-Based Segmentation)

這類方法根據像素之間的相似性將它們合併到同一個區域。

• 區域生長 (Region Growing)：

  • 原理： 從一個或多個「種子點」開始，逐步將周圍滿足特定相似性準則（如灰度值在一定範圍內、紋理相似）的像素加入到當前區域中，直到沒有符合條件的相鄰像素為止。

  • ImageJ中的區域生長：

    • ImageJ核心功能不直接包含區域生長工具，但許多插件提供了此功能。

    • 例如，可以使用 Plugins > Segmentation > Region Growing (如果已安裝) 或其他相關插件。

    • 實作步驟通常包括：

      1. 選擇一個或多個像素作為種子點（可以使用Point Tool手動標記）。
      2. 設定生長條件（如灰度值範圍、相似度閾值）。
      3. 運行插件進行生長。

• 分水嶺算法 (Watershed Algorithm)：

  • 原理： 將灰度影像想像成地形，灰度值代表海拔高度。分水嶺算法模擬降雨後水流匯集到「集水盆」的過程，集水盆之間的邊界即為分割結果（分水嶺線）。通常應用於影像的梯度圖或距離變換圖。
  • 應用： 常見於分離相互接觸或重疊的物體，如細胞或顆粒。
  • 過分割處理： 分水嶺算法容易產生過分割（將單一物體分割成多個區域），需要結合標記點或其他預處理/後處理步驟來控制分割結果。

  • ImageJ中的分水嶺算法：

    ImageJ的 Process > Binary > Watershed 功能應用於二值化影像，通常用於分離二值化後接觸的物體。 更進階的分水嶺實現（如基於標記的分水嶺）通常需要安裝插件，例如 Fiji 中的 Process > Segmentation > Morphological Segmentation 或其他提供此功能的插件。 實作流程可能涉及： 1. 對原始影像進行預處理（如降噪、增強對比）。 2. 計算影像的梯度圖或進行距離變換。 3. 確定標記點（每個集水盆內的一個點，代表一個物件）。這可以通過尋找局部最小值或利用形態學操作實現。 4. 應用分水嶺算法。 5. 進行後處理（如去除小區域）。

機器學習與深度學習方法

這類方法通過從大量標記好的影像數據中學習特徵和模式，自動執行分割任務。

• 監督式學習： 需要人工標記訓練數據。常見算法包括支持向量機（SVM）、隨機森林等。
• 深度學習： 使用卷積神經網路（CNN）等複雜模型，能夠自動學習更抽象、更魯棒的特徵。

ImageJ中的機器學習/深度學習分割

• Trainable Weka Segmentation： Plugins > Segmentation > Trainable Weka Segmentation 基於機器學習庫Weka，允許使用者選擇一系列像素特徵（如灰度、邊緣、紋理）並手動標記不同類別的區域（如細胞核、細胞質、背景）作為訓練數據。 然後，它會訓練一個分類器（如隨機森林），並用訓練好的模型對整個影像進行像素分類，從而實現分割。 實作步驟：

        1.  打開影像並啟動Trainable Weka Segmentation插件。
        2.  選擇用於訓練的影像特徵。
        3.  創建不同的類別（Class）。
        4.  使用畫筆工具在影像上標記屬於各個類別的區域作為訓練樣本。
        5.  選擇一個分類器。
        6.  點擊「Train classifier」進行模型訓練。
        7.  點擊「Create result (Plugin)」應用模型到當前影像或批量應用到多個影像。

• 深度學習整合 (Deep Learning Integration)：
  • StarDist： 是一個專門用於密集細胞核或星形物體實例分割的深度學習模型，在Fiji中作為插件提供 (Plugins > Segmentation > StarDist)。它能夠區分相互接觸的個體物件。
  • U-Net： 是一種經典的用於生物醫學影像分割的深度學習架構，在Fiji中可以通過如 deepImageJ (Plugins > deepImageJ) 或其他插件/腳本來運行預訓練好的U-Net模型或進行推理。
  • DeepLab： 另一種常用的深度學習分割模型，也可通過插件或腳本在ImageJ中使用。

分割後處理 (Segmentation Post-processing)

分割結果可能包含雜訊（小孔洞、孤立的小區域）、邊界不平滑或物體連接不緊密等問題，需要進行後處理來優化結果。

• 形態學操作 (Morphological Operations)： Process > Binary 提供了多種形態學操作，如 Dilate, Erode, Open, Close, Outline, Skeletonize, Fill Holes 等。這些操作通常應用於二值化影像。

  • 膨脹 (Dilation)： 使物體邊界向外擴張，用於連接斷開的物體、填充小孔洞。
  • 侵蝕 (Erosion)： 使物體邊界向內收縮，用於去除小物體、分離連接較弱的物體。
  • 開運算 (Opening)： 先侵蝕後膨脹，用於去除孤立的小點和消除物體邊緣的毛刺。
  • 閉運算 (Closing)： 先膨脹後侵蝕，用於填充物體內的小孔洞和連接鄰近的物體。
  • ImageJ中的形態學操作：

• 物件過濾與分析 (Object Filtering & Analysis)：

  • 物件標記 (Object Labeling)： 將二值化影像中的每個連通區域標記為一個獨立的物件。
  • 過濾： 根據物件的屬性（如面積、周長、圓度、強度等）去除不符合條件的物件（如過小或過大的區域）。
  • 分析： 測量每個物件的各種屬性。

  • ImageJ中的物件分析：

    通常在二值化或分割後生成標記影像後進行。 Analyze > Analyze Particles... 是ImageJ中用於物件分析的核心功能。 - 它首先會尋找二值化影像中的連通區域。 - 使用者可以設定「Size」和「Circularity」等過濾條件來排除不需要的物件。 - 勾選「Display results」會在Results視窗中顯示每個物件的測量結果（如面積、周長、質心等）。 - 勾選「Show: Outlines」會在原始影像上繪製物件輪廓；「Show: Masks」會創建每個物件的二值化遮罩；「Show: Count Masks」會創建標記影像。 - Analyze > Measure 用於測量當前選區或整個影像的屬性。 - Analyze > Set Measurements... 用於選擇要在 Analyze Particles 或 Measure 中進行的測量項目。

實作範例與練習 (Examples & Practice)

範例：細胞核分割 (以閾值分割與後處理為例)

1. 影像準備： 載入細胞核染色的螢光影像（如DAPI染色影像）。可能需要進行背景校正或對比度增強。

2. 分割步驟：

   應用自動閾值分割，例如 Image > Adjust > Threshold... 並選擇 Otsu 算法，然後點擊 Apply 進行二值化。

   • 後處理： 使用形態學操作 Process > Binary > Open 去除小雜訊點。 使用 Process > Binary > Fill Holes 填充細胞核內部可能存在的孔洞。 如果細胞核有接觸，可能需要考慮使用 Process > Binary > Watershed 進行分離（在Open操作之後進行）。

3. 物件標記與分析：

   使用 Analyze > Analyze Particles... 功能，設定合適的尺寸過濾條件（去除過小或過大的物件），並選擇需要測量的參數（如面積、數量）。這將標記出每個細胞核並提供定量數據。

常見問題解決 (Common Problem Solving)

• Q: 分割結果不完整或有遺漏？ A: 檢查原始影像的質量，可能需要先進行預處理（如降噪、增強對比度）。調整分割方法的參數（如閾值範圍、邊緣檢測靈敏度、區域生長準則）。考慮使用多種分割方法結合（如先閾值分割，再用區域生長修補）。對於機器學習方法，可能需要更多的訓練數據或調整特徵選擇。
• Q: 分割結果過分割（一個物件被分成多個區域）或欠分割（多個物件被合為一個區域）？ A: 過分割在分水嶺算法中常見，可以通過對梯度圖進行平滑、調整標記點或使用形態學後處理（如閉運算再分水嶺）來緩解。欠分割可能由閾值設置過低或相似度準則過於寬鬆導致，需要調整參數。形態學操作（如開運算分離粘連物體，閉運算填充孔洞）是重要的後處理步驟。