從像素到微米：ImageJ 基礎測量與校正

本章節將引導你完成 ImageJ 中最基礎也最重要的一趟學習旅程：從認識像素（pixel）開始，到學會如何賦予它真實的物理意義（如微米, µm）。完成後，你將能進行有意義的科學測量。

1. 熟悉 ImageJ 操作介面

當你打開 ImageJ/Fiji 時，會看到一個簡潔的主視窗，它主要由以下幾個部分組成：

選單列 (Menu Bar): 位於最上方，包含了所有功能指令，如 File (檔案)、Edit (編輯)、Image (影像)、Process (處理)、Analyze (分析) 等。
工具列 (Toolbar): 選單列下方的一排圖示按鈕，提供了快速選取、繪圖、測量等常用工具。
狀態列 (Status Bar): 位於主視窗底部，會顯示游標位置的像素座標和數值、影像資訊以及記憶體使用狀況。這是觀察影像即時資訊的重要窗口。

讓我們開啟一張影像來實際感受一下。

在 ImageJ 中，點擊選單列的 File > Open Samples > Fluorescent Cells.tif。
觀察狀態列： 將滑鼠游標在影像上移動，注意看狀態列的變化。你會看到 x, y 座標和 value (像素值) 不斷更新。
熟悉工具列：
- 點擊放大鏡工具 (Zoom Tool)，在影像上點擊左鍵放大、右鍵縮小。
- 點擊手形工具 (Scrolling Tool)，按住左鍵拖曳以移動放大的影像。

熟悉快速鍵可以大幅提升你的操作效率：

影像分析的核心是測量。ImageJ 提供了多種工具來進行測量。

直線工具 (Line Tool): 用於測量兩點之間的長度與角度。
矩形/橢圓選擇工具 (Rectangle/Oval Selection): 用於圈選特定區域進行面積或強度分析。按住 Shift 鍵可繪製正方形或正圓。
多邊形選擇 (Polygon Selection): 用於選擇不規則形狀。

現在，讓我們試著測量一個細胞核的直徑。

觀察結果： 你會看到 "Length" (長度) 這一欄顯示了一個數值。但這個數值的單位是什麼？預設情況下，它的單位是 pixels (像素)。

關鍵問題： 一個長度為 "80 pixels" 的細胞核到底有多大？是 8 微米 (µm) 還是 80 微米？如果沒有進一步的資訊，這個測量結果是沒有科學意義的。這就是我們需要「比例尺校正」的原因。

比例尺校正 (Scale Calibration) 的目的，就是建立「像素」與「真實物理單位」（如 µm, mm, cm）之間的換算關係。

要進行校正，我們需要一個已知長度的參考物。在真實實驗中，這通常是顯微鏡拍攝的校正尺 (Calibration Scale)。在這裡，我們使用另一張範例影像來模擬這個過程。

開啟範例影像 File > Open Samples > blobs.gif。這張影像包含一些黑色斑點。
假設我們已知：影像中最左上角那個最大斑點的實際直徑是 20 微米 (µm)。
使用直線工具 (Line Tool)，盡可能精確地畫出這個斑點的直徑。
執行 Analyze > Set Scale...。
在彈出的對話框中：
- Distance in pixels: ImageJ 會自動填入你剛剛畫的線段長度（像素單位）。
- Known distance: 輸入我們已知的實際長度，這裡填 20。
- Unit of length: 輸入物理單位，這裡填 um (代表微米)。
- Global: 勾選此項。這會讓這個校正設定應用於之後開啟的所有影像，直到你關閉 ImageJ 或設定新的比例尺。
- 點擊 OK。
驗證校正：
- 再次使用直線工具測量同一個斑點的直徑。
- 按下 Ctrl + M。
- 現在，"Results" 視窗中的 "Length" 應該會非常接近 20，並且單位已經變成了 um！

在發表或展示影像時，加上一個視覺化的比例尺圖示是非常專業且必要的做法。