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螢光強度定量：分析細胞核/質的訊號分佈

教學影片

我們將以 ImageJ 內建的 Fluorescent Cells.tif 範例影像為基礎，學習影像強度的定量。

1. 案例介紹與準備工作

認識範例影像

  1. 開啟影像： File > Open Samples > Fluorescent Cells.tif。
  2. 影像資訊： 這是一張牛肺動脈內皮細胞的螢光影像，為一個包含三個8位元通道的合成影像（Composite Image）。
    • 藍色 (Blue): DAPI 染劑，標定細胞核 (Nucleus)。
    • 綠色 (Green): Bodipy FL 染劑，標定微管蛋白 (Tubulin)，主要分佈於細胞質。
    • 紅色 (Red): Texas Red 染劑，標定絲狀肌動蛋白 (F-Actin)，主要分佈於細胞質的細胞骨架。

分析目標

我們的目標是定量分析微管蛋白（綠色通道）在細胞核與細胞質中的螢光強度。

觀察影像品質

這個影像目前是以「Composite Mode」（合成模式）來顯示，它將多個獨立的灰階通道（每個通道通常指定不同的偽彩色，例如通道 1 為紅色，通道 2 為綠色，通道 3 為藍色）疊加在一起顯示，形成一個合成的彩色影像，方便同時觀察所有通道的訊號，並視覺化它們之間的空間關係（共定位）。雖然它看起來像一個 RGB 影像，但底層的數據仍然是分離的灰階通道。

Image › Color › Channels Tool...可以切換顯示的模式，可以切換成Color或Grayscale模式。

為了分別觀察不同通道的影像品質，請利用Image › Color › Split Channels將影像分成不同通道來分析。

在進行量化影像前，我們必須注意影像的幾項品質:

  1. 是否產生有損壓縮(lossy compression)嗎？
  2. 最高亮度資訊是否已經丟失？
  3. 是否均勻背景？是否偵測器偏移(uniform background / detector offset)？

有損壓縮(lossy compression)

使用放大鏡工具放大影像，是否會看到 8x8的方形偽影(square shaped artifacts)。若有，可能被進行過JPEG 壓縮，因為JPEG是基於 8x8 像素區塊進行壓縮的演算法，每個區塊都會損失各自的高頻訊號，因此彼此區塊會產生不連續的界面，產生明顯區塊邊界。

最高亮度資訊是否已經丟失？

影像採樣時，進入偵測器的光線量過多，超出了偵測器所能線性響應的範圍，因此產生飽和(saturated)，這會使得感測器的讀數限制在最大值（例如255），超過這個數字的都會被剪切(clipped)，因此會觀察到過度曝光(overexposed)。

我們可以針對個別通道進行Analyze > Histogram觀察個別通道的最高像素值的數量(例如pixel value = 255 )，你可以勾選Log，讓數量少的數值也能清楚顯示在直方圖上（Y軸非線性顯示，而是變成對數）。

請注意藍色通道中的直方圖，強度值255的像素數量有108個。（也許真實強度有高於255的，但卻被剪切了）

均勻背景/偵測器偏移

當沒有任何光子進入偵測器，理論上偵測器應該會採樣到0值，但如果產生偵測器偏移（detector offset），則應該是黑色的區域就會產生非零的數值。你可以用兩種方式檢查：

請觀察綠色通道的直方圖和另外兩個通道的直方圖差異。

如果影像產生這種offset，則在後續做共定位分析時，需要進行背景減除(Background Subtraction)或零偏移校正(Zero Offset Correction / Bias Correction)的，否則會影響一些需要用像素絕對強度來運算的係數，例如Manders係數。

如何進行偏移校正

校正的目的是為了去除所有來自非目標分子或環境的光學噪音，突出真實的訊號。（想像一下大家都站在箱子上量身高，最後得到的身高應該如何校正回真實身高？）

操作方式：

設定測量參數

在開始分析前，先設定需要測量哪些數據。

  1. 執行 Analyze > Set Measurements...。
  2. 勾選以下重要參數：
    • Area: 物件的面積。
    • Mean gray value: 訊號的平均強度。
    • Integrated Density: 訊號的總量（= Area × Mean gray value）。
    • Display label: 在結果中顯示影像標籤，方便識別數據來自哪個影像。
  3. 點擊 OK。

1.定義細胞核區域

DAPI的藍色通道有清晰的細胞核輪廓，可以用來定義細胞核的選區 (ROI)。

  1. 分離通道：：執行 Image > Color > Split Channels。執行Image > Rename..重新命名成 red, green, blue 三張獨立的灰階影像。
  2. 分割細胞核：
    • 選取 (blue) 這張影像。
    • 執行 Image > Adjust > Threshold... 來選取細胞核。
    • 點擊 Apply 將其轉換為二值化影像。
  3. 將細胞核 ROI 加入manager：
    • 執行 Analyze > Analyze Particles...。
    • 設定 Size 來過濾掉小雜訊，例如 50-Infinity。
    • 勾選 Add to Manager，然後點擊 OK，所有細胞核的輪廓都被加入到 ROI manager中了。
    • 在 ROI manager 刪掉不屬於細胞核的部份，例如部份文字可能被選入 ROI。

2. 定義細胞區域

選取 (red) 通道影像，因為能大致顯示整個細胞的輪廓。

  1. 定義細胞粗略範圍
    • 選擇紅色通道影像，執行Image > Duplicate..，複製一張，接下來的操作都用這張圖來運算。
    • 使用工具列的圓形圈選工具，右鍵選擇Selection Brush Tool，這可以讓你用筆刷的方式圈出細胞界線。針對左上角的單一細胞，用此工具粗略畫出細胞範圍。
    • 執行Edit › Selection › Make Inverse，這會變成選取細胞之外的部份。再執行Edit > Clear，這可以讓細胞之外的區域都清除。再執行一次Edit › Selection › Make Inverse，又可以選回原來的細胞範圍。
  2. 定義細胞精確範圍
    • 執行Image > Adjust > Threshold..選擇出細胞的精細範圍，中間有洞沒關係。按下apply，此影像會轉成遮罩影像。
    • 針對此遮罩影像，執行Process › Binary › Fill Holes，可以將細胞之間的界線填滿，這樣就產生一個細胞精細輪廓的二值化遮罩影像。
    • 針對此遮罩影像，執行Edit › Selection › Create Selection，可以將其轉為選區，在 ROI Manager按下Add，就可以有單獨一個細胞的ROI。可以點擊 Rename... 將其命名為 Cell-1。

3. 定義細胞質區域

  1. 在ROI Manager找尋屬於前述細胞的細胞核區域，將之rename為Nu-1。
  2. 按ctrl，同時選中Cell-1和Nu-1，選擇點擊 More >> 按鈕，選擇 XOR。(XOR是互斥，請理解成「有你就沒有我，有我就沒有你」)
  3. 這會產生一個新的 ROI，其形狀就像一個甜甜圈，這就是我們需要的細胞質區域。
  4. 將這個新的 "甜甜圈" ROI 也加入manager，並命名為 Cyto-1。
  5. 你可以選中Cyto-1之後，執行Edit › Selection › Create Mask，就可以看見這個甜甜圈形狀的細胞質。

現在，我們的 ROI manager中應該至少有三個 ROI：Nu-1、Cell-1 和 Cyto-1。

進行定量分析

你可以針對單一影像的多個ROI進行測量，也可以針對一個stack的每個slice，作多個ROI的測量。

  1. 單一影像，多個ROI的測量

    • 同時選取你要測量的ROI，並選擇要測量的影像，按下ROI manager的Measure

  2. 單一stack，多個ROI的測量

    • 你可以再開啟原始的Fluorescent Cells.tif，或是將已經經過背景扣除的三張影像再透過Image > Color > Merge Channels或是Imagew > Stacks > Images to Stack組合成stack。
    • 在 ROI manager視窗中，選中多個ROI，點擊 More >> 按鈕，然後選擇 Multi Measure。

共定位分析

在完成細胞核、細胞質、細胞區域的 ROI 定義後，我們可以直接進行螢光通道的共定位分析。以下以 ImageJ 內建的 Coloc2 工具為例，說明操作流程與指標解讀。

操作步驟

  1. 準備影像與 ROI

    • 前述步驟已將紅色（F-Actin）與綠色（Tubulin）通道分離，並建立細胞、細胞核、細胞質的 ROI。
    • 確認 ROI Manager 中已包含欲分析的區域（如 Cyto-1、Nu-1、Cell-1）。

  2. 啟動 Coloc2 分析

    • 執行 Analyze > Colocalization Analysis > Coloc 2。
    • 在 Coloc2 視窗中，分別選擇紅色與綠色通道影像作為 Channel 1 和 Channel 2。
    • 在 Mask/ROI 欄位選擇欲分析的 ROI（例如 Cyto-1）。
    • 設定分析參數（如 Pearson、Manders、Costes、Li 等），可依需求勾選。

  3. 執行與結果解讀

    • 點擊「OK」開始分析。
    • 結果視窗會顯示各項共定位指標數值與相關圖像（散點圖、遮罩、回歸線等）。
    • 數值結果會顯示於 ImageJ Log 視窗，可複製匯入統計軟體或試算表。

主要指標簡介